Voortgang DCMD onderzoek 2025
Dominante cystoïde macula dystrofie (DCMD) is een erfelijke netvliesaandoening, waarvan de genetische oorzaak tot op heden onbekend is. Recent zijn wij een afwijking in het DNA van personen met DCMD op het spoor gekomen, waarvan wij denken dat dit mogelijk de oorzaak is van DCMD. De DNA-afwijking is gevonden in het GEN-X gen: er is een gedeeltelijke verdubbeling aangetoond van het GEN-X gen.
Daarnaast is er met behulp van recent onderzoek ook een afwijking in het RNA gevonden van personen met DCMD: een deel van de DNA-verdubbeling is ook terug te zien in het GEN-X-RNA. Het GEN-X-RNA is normaal 434 RNA-nucleotiden lang, het GEN-X-RNA dat is gevonden in DCMD-personen is 4006 RNA-nucleotiden lang.
Op dit moment weten we hoe DCMD zich presenteert in patiënten, we weten wat de (waarschijnlijke) oorzaak van de ziekte is op genetisch niveau, nu resteert alleen de vraag: “Hoe veroorzaakt deze verlenging van GEN-X DCMD op moleculair niveau?”. Het doel van dit vervolgonderzoek is om de moleculaire gevolgen te bepalen van het verlengde GEN-X-RNA en te achterhalen waarom dit schadelijk is voor de cellen in het netvlies, met uiteindelijk de ontwikkeling van DCMD tot gevolg.
Het is voor ons onbekend wat de gevolgen zijn van het verlengde GEN-X-RNA. We hebben twee verschillende werkhypotheses geformuleerd:
- Er kan geen normaal-werkend GEN-X-eiwit worden gemaakt van het verlengde GEN-X-RNA, de werking van het GEN-X-eiwit is ernstig verstoord (doelstelling
- Andere eiwitten in de cel kunnen binden aan het verlengde GEN-X-RNA. De werking van deze andere eiwitten is hierdoor ernstig verstoord (doelstelling 2).
Doelstelling 1: Gevolgen van de DNA-verdubbeling op het GEN-X-eiwit
Om GEN-X op eiwit-niveau te onderzoeken zijn we afhankelijk van een specifiek antilichaam: een specifiek molecuul wat gebruikt kan worden om het GEN-X-eiwit specifiek aan te tonen en te ‘kleuren’ (labelen). Dit biedt ons inzichten in mogelijke defecten van de productie van het GEN-X-eiwit, wat ons verder helpt bij het bepalen van het onderliggende mechanisme van DCMD. In het afgelopen jaar hebben we een specifiek antilichaam voor GEN-X laten maken door een commercieel bedrijf. In de eerste periode van dit jaar hebben we ons gericht op het valideren van dit GEN-X antilichaam: is dit antilichaam inderdaad specifiek en geschikt om GEN-X te kleuren?
We hebben dit GEN-X antilichaam getest door middel van zowel Western Blot als Immunocytochemie. Op basis van deze resultaten blijkt echter dat het antilichaam niet specifiek lijkt te zijn voor GEN-X. Zo is er in het Western Blot experiment (een test om de grootte van het GEN-X-eiwit te bepalen) te zien dat er kleuring is op verschillende groottes, wat aangeeft dat er veel verschillende eiwitten worden aangekleurd. Dit is geobserveerd in materiaal van zowel controle-(gezonde) als DCMD-cellen. Er zijn geen verschillen te zien in eiwitten die worden aangetoond in materiaal van controle-cellen t.o.v. DCMD-cellen.
Om toch meer te weten te komen over de GEN-X-eiwit functie hebben we een antilichaam gericht op GEN-Y aangeschaft. GEN-Y heeft een functie in hetzelfde eiwit complex als GEN-X: het GEN-eiwit complex. Wanneer we afwijkingen zien in GEN-Y zou dit erop kunnen wijzen dat er problemen zijn in het GENX-en-Y-eiwit complex, en dat de betrokken processen verstoord zijn.
De Western blot-experimenten gericht op GEN-Y hebben veelbelovende resultaten opgeleverd: in controlecellen is een duidelijke en specifieke GEN-Y-kleuring zichtbaar op de verwachte moleculaire grootte. Nu het GEN-Y-antilichaam is gevalideerd, staan begin 2026 vervolgexperimenten gepland met gebruik van DCMD-cellen.
Daarnaast hebben we het GEN-Y antilichaam ook getest met behulp van immunocytochemie: een methode waarmee aangetoond kan worden waar een eiwit zich specifiek in een cel bevindt. We zien in de immunocytochemie experimenten dat het anti-GEN-Y antilichaam kleuring geeft in de mitochondriën. Dit komt precies overeen met de verwachte locatie van GEN-Y in de cellen. Dit in tegenstelling tot de GEN-X kleuring: dit antilichaam liet een kleuring van de volledige cel zien. Dit bevestigt nogmaals dat het gebruikte anti-GEN-X niet naar behoren werkt. Er zijn geen verschillen geobserveerd in de mitochondriële GEN-Y-kleuring in controle cellen t.o.v. patiënt cellen.
Tot op heden hebben we geen aanwijzingen kunnen vinden voor defecten in het GEN-X-eiwit. Begin 2026 zijn de laatste Western blot experimenten ingepland. Ondanks dat we deze resultaten afwachten voordat hypothese 1 volledig afgestreept kan worden, hebben we besloten om onze focus voor nu te verschuiven naar de tweede doelstelling en hypothese van het project.
Doelstelling 2: Lokalisatie studies van verlengd GEN-X-RNA m.b.v. RNAscope
Om de cellulaire lokalisatie van het verlengde GEN-X-RNA te onderzoeken hebben we gebruikt gemaakt van een nieuwe methode genaamd ‘RNAscope’. Hiermee kunnen we zien waar het GEN-X-RNA zich bevindt in de cel, of er verschillen zijn tussen GEN-X-RNA bij personen zonder DCMD en verlengd GEN-X-RNA zoals bij personen met DCMD, en kunnen we bepalen of er mogelijke andere eiwitten in de cel binden aan het RNA molecuul.
We hebben twee verschillende RNA-labels (of ‘vlaggetjes’) ontwikkeld: een groen label gericht tegen normaal GEN-X-RNA, en een rood label, gericht tegen verlengd GEN-X-RNA. De RNA-scope methode is nog niet eerder gebruikt binnen onze onderzoeksteams. Om deze nieuwe methode te gaan gebruiken en te optimaliseren hebben we de eerste experimenten als technische test uitgevoerd op fibroblast-cellen (geïsoleerd uit een huidbiopt) van een controlepersoon zonder DCMD, en een persoon met DCMD. Met deze eerste experimenten hebben we het GEN-X RNA-scope succesvol geoptimaliseerd en geïmplementeerd. Een kleuring van normaal GEN-X-RNA is aangetoond in alle fibroblast cellen. Er was geen kleuring te zien in de cellen met verlengd van GEN-X-RNA., wat in principe past met onze verwachting, aangezien het gaat om een netvlies-specifiek RNA-defect. Hierdoor zijn de fibroblast cellen geen geschikt studiemodel om conclusies aan te verbinden. Voor vervolgonderzoek hebben we (controle- en DCMD-) stamcellen opgegroeid en gestimuleerd tot groei naar netvliesachtige cellen. Deze cellen liggen dichter bij het aangetaste netvliesweefsel. Helaas hebben we de RNAscope experimenten op deze cellen moeten uitstellen, vanwege leveringsproblemen van onze bestelde materialen bij de RNAscope fabrikant. De cellen en de experimentele setup liggen al klaar voor alle experimenten, echter is deze levering een limiterende factor dat het proces voor minstens 3 maanden vertraagt. Volgens de laatste berichtgeving van de fabrikant wordt de nieuwe levering in januari 2026 verwacht. Ondanks deze tegenslag zijn we optimistisch dat de RNA-scope cruciale nieuwe inzichten in het onderzoek zullen brengen: de resultaten zullen aantonen of onze hypothese dat zogeheten RNA-foci (ophopingen van RNA- en eiwitmoleculen) het onderliggende moleculaire mechanisme kunnen zijn van het ziektebeeld van DCMD.
Doelstelling 3: Overexpressie van een GEN-X-DCMD construct
Om het DCMD-onderzoek nog verder te ondersteunen hebben we een nog derde en niet eerder benoemde onderzoeksbenadering opgezet: het maken van een artificieel of kunstmatig GEN-X-RNA construct te maken om hiermee het GEN-X-DNA defect na te bootsen. Met behulp van dit construct kunnen we het GEN-X-RNA tot overexpressie (de cel aansporen tot excessief aanmaken van verlengd GEN-X-RNA) brengen en het DCMD-proces nabootsen in de cellen. Hierdoor kunnen we de gevolgen van verlengd GEN-X-RNA in meer detail en binnen een simpelere context bestuderen. Dit helpt ons om het moleculaire mechanisme van deze variant en de directe gevolgen in cellen vast te stellen.
De eerste stap hiervoor was het ontwikkelen van specifieke RNA-primers die gebruikt kunnen worden om het GEN-X-RNA met de verdubbeling te kunnen produceren en te kloneren in een construct. Met deze RNA-primers is het gelukt om het verlengde GEN-X-RNA specifiek te produceren. Voor de vervolgstappen hebben we extreem hoge concentraties van onze producten nodig om het verder te kunnen gaan gebruiken. Hiervoor zijn optimalisaties gaande.
(Voorlopige) conclusies van het onderzoek
Op basis van de tot dusver behaalde resultaten m.b.v. eiwittechnieken en RNAscope, hebben we besloten we ons voorlopig te richten op de hypothese dat andere eiwitten in de cel kunnen binden aan het verlengde GEN-X-RNA molecuul. Door deze niet-natuurlijke binding kan de gezonde functie van deze eiwitten ernstig worden verstoord. In meer detail suggereren de bevindingen dat we mogelijk te maken hebben met ‘RNA foci’, een mechanisme waarin verlengde RNA-moleculen clusteren en daarmee specifieke RNA-bindende eiwitten vangen. Ditzelfde mechanisme is eerder beschreven voor een ziektebeeld zoals Myotone dystrofie type 1. Doelstelling voor het komende jaar is om de RNA-scope experimenten af te ronden, en ondersteunend bewijs voor deze hypothese te verzamelen. In afwachting van de vervolgexperimenten door leveringsproblemen ligt nu de focus op doelstelling 3, en het testen van digitale (AI) tools die voorspellingen kunnen doen over welke eiwitten mogelijk zouden kunnen clusteren binnen de RNA foci.
Aanvullende bevindingen.
Een onverwachte uitkomst van dit project is dat de vorming van RNA foci een reële mogelijkheid is voor het onderliggende mechanisme achter DCMD. Dit is een uniek scenario aangezien dit tot dusver alleen nog maar in neuronale ziektebeelden gevonden is, en kan dus meer inzicht geven in hoe dit mechanisme een rol speelt in verschillende weefsels en aandoeningen.
Hoewel we deze hypothese slechts bij fibroblasten hebben getest, zijn deze eerste resultaten veelbelovend, en bieden ze waardevolle aanknopingspunten voor vervolgonderzoek, zoals het gebruik van netvliesachtige cellen. We zijn afhankelijk van de leveringstijd van de producten die hiervoor nodig zijn, die helaas vertraagd is door een productiefout van de leverancier.
Wij zijn ervan overtuigd dat we aan het einde van dit project essentiële aanknopingspunten hebben voor de ontwikkeling van DCMD. Dit kan nieuwe inzichten bieden in deze aandoening, en kan leiden tot mogelijke therapeutische opties in de toekomst.