Eindverslag DCMD project 15-1-2014 t/m 15-1-2018

Projecttitel: Op zoek naar de moleculair genetische oorzaak van cystoide macula degeneratie

Projectleiders (Radboudumc, Nijmegen):

Prof. dr. F.P.M. Cremers, afd. Genetica

Prof. dr. C.B. Hoyng, afd. Oogheelkunde

Dr. A.I. den Hollander, afd. Oogheelkunde & Genetica

In 1994 werd door een Nijmeegse onderzoeksgroep het chromosomale gebied bepaald waarin het oorzakelijke defect voor dominante cystoide macula degeneratie (DCMD) zich moest bevinden. Dit gebied bevindt zich op de korte arm van chromosoom 7, en omvatte circa 1% van al het menselijke DNA. In daaropvolgende studies werd dit gebied verder ingeperkt, en maar werd er zonder succes gezocht naar het oorzakelijke defect door het analyseren van de DNA sequenties van de circa 50 genen in dit gebied.

In dit lopende project zijn de volgende methodes gebruikt om de erfelijke oorzaak voor deze familie te achterhalen:

1.         Bevestiging chromosomale locatie van het DCMD gendefect:

In eerdere studies hebben wij gebruik gemaakt van zogenaamd ‘hoog-polymorfe’ DNA markers om het kritische gebied te bepalen van het DCMD gendefect. Hierbij werd aanvankelijk een gebied van circa 1% van het humane genoom op chromosoom 7 bepaald en daarna, door de inclusie van meer aangedane personen, een verkleining van dit gebied naar circa 0.2% van het humane genoom. In de circa 50 genen die zich in dit gebied bevinden kon tot dusverre (zie punt 2.) nog geen duidelijk oorzakelijke mutatie worden gevonden. Om er zeker van te zijn dat er geen verwisselingen van samples zijn gemaakt hebben wij deze studie herhaald met een andere set DNA markers, gebaseerd op zogenaamde ‘single nucleotide polymorphisms’. In deze studie konden wij het eerdere resultaat bevestigen.

2.         DNA sequentie-analyse methode:

We hebben potentieel oorzakelijke mutaties in de eiwit-coderende elementen van het kritische chromosomale bestudeerd. De meeste van deze blijken niet voor te komen bij alle aangedane personen en kunnen daarmee niet oorzakelijk zijn. Van enkele mutaties die wel bij alle aangedane aanwezig zijn (en afwezig bij niet-aangedane familieleden) zijn we nog niet overtuigd dat ze de DCMD kunnen veroorzaken. 

De gegevens van de meest complete DNA sequentiemethode, “heel genoom sequentie analyse”, zijn geanalyseerd van 1 aangedane persoon. De analyse van deze gegevens staat wereldwijd nog in de kinderschoenen, vanwege de complexiteit en hoeveelheid van de data. Toch hebben we enkele kandidaat varianten kunnen bekijken op aanwezigheid bij aangedane personen en afwezigheid bij gezonden personen uit de familie, waarbij deze allen zijn uitgesloten. We hopen spoedig DNA van een tweede aangedaan familielid te analyseren middels deze methode waardoor we bij voorbaat al een groot gedeelte van de varianten kunnen uitsluiten als oorzaak.

3.         Het kweken van netvliescellen en RNA sequentie-analyse:

Van de duizenden verschillende RNAs en eiwitten die in het oog aanwezig zijn, blijken de RNAs en eiwitten die betrokken zijn bij erfelijke oogziekten vaak alleen in het oog voor te komen en niet in andere weefsels. Om deze reden hebben wij huidcellen van 2 aangedane personen omgezet in stamcellen en deze geïnduceerd naar netvliescellen. Na deze langdurige transformatie van cellen vormen deze cellen samen een organoïde en bootsen hiermee een netvlies na van het persoon waarbij de huidcellen zijn afgenomen. Uit deze organoïde wordt het RNA onttrokken en inmiddels met het RNA (dat op dezelfde manier verkregen is) van een gezond persoon vergeleken. Het analyseren van deze resultaten is en blijft een uitdaging waarbij expertise van andere deskundigen vereist is.

4.       Onderzoek 2e helft 2016 en 2017:

Vanaf 1-6-2016 is dr. Susanne Roosing gestart voor het vinden van het oorzakelijke gendefect in de DCMD familie en een andere dominante familie met retinitis pigmentosa. Zij zal niet alleen de RNA analyses van de netvlies-achtige cellen voor haar rekening nemen, maar tevens een aantal nieuwe analyses uitvoeren door gebruik te maken van bloed samples van patiënten. Dit is geen gemakkelijke zoektocht omdat we nog geen aanwijzing hebben over het gendefect. We hopen nu de omgekeerde weg te bewandelen. We hoopten de consequenties van het gendefect aan te tonen indien metabolieten in het bloed afwijkingen te zien zouden geven die een aanwijzing zouden kunnen geven voor het betrokken gen. Echter, deze ‘pilot’ analyse heeft geen duidelijke aanwijzingen opgeleverd voor vervolgonderzoek.

Ook zullen de we ‘heel genoom’ sequentie-analyses uitbreiden naar meer patiënten. De analyse van 1 persoon resulteerde in het vinden van een groot aantal DNA varianten, maar het is heel moeilijk om hierin het oorzakelijke defect te vinden. Door het analyseren van meer personen van deze familie, en wellicht het bepalen van de DNA sequentie van patiënten uit andere (buitenlandse) families, hopen wij gemeenschappelijke afwijkingen te vinden.

5.       Onderzoek in 2018:

In December 2017 is DNA van 3 CYMD patiënten van deze familie ingestuurd voor analyse van het volledige genoom. Deze data worden medio April/begin Mei 2018 terug verwacht. Doordat we DNA insturen van personen die het verst van elkaar verwijderd zijn in de familie (en daarmee genetisch de grootste afstand tot elkaar hebben) kunnen we snel inzoomen op de bouwstenen die in alle drie de personen hetzelfde zijn. Daarnaast hoeven we dan niet meer te kijken naar bouwstenen die slechts door twee van de drie personen worden gedragen, welke immers niet de oorzakelijke verandering kunnen zijn. Daarnaast beperken we onze analyse tot het gebied waarin het gendefect wordt vermoed op grond van eerdere familiestudies. Hopelijk vinden we op deze manier de informatie die voor deze aandoening van belang is.

Het RNA dat uit netvliesachtige cellen is verkregen van CYMD patiënten zijn in Januari 2018 verwerkt voor analyse. Het verkrijgen van dit type data is erg nieuw. Mogelijk zullen we meerdere pogingen moeten wagen om deze technologie goed te gebruiken en de data goed te kunnen interpreteren.

6.       Personen betrokken bij het onderzoek:

Kweken van netvliesachtige cellen:  Silvia Albert (postdoc), Angelique Goercharn-Ramlal (analist) en Anke den Engelsman-van Dijk (analist)

Analyse genoom sequenties: M. Imran Khan (postdoc) en Shazia Micheal (postdoc), in samenwerking met dr. C. Rivolta (Lausanne)

Bepaling locatie gendefect:  Anna Tracewska (promovendus) en Shazia Micheal (postdoc)

Coördinatie onderzoek, metabolieten analyse, analyse Genoom sequenties (2018), initiatie PacBio aanpak voor DCMD: Susanne Roosing (postdoc)

7.       Budget voor genetische studies afdeling Genetica:

Budget voor periode 1-9-2013 t/m 1-11-2015:

-          Postdoc: 6.8 persoonsmaanden (10.5):                                 € 34.000

-          Analist: 2.6 persoonsmaanden (7.5):                                     €   9.000

-          Materialen:                                                                                 € 14.000

Subtotaal:                                                                                     € 57.000

Overhead (8%):                                                                             € 4.560

Totaal:                                                                                          € 61.560

Ontvangen in 2014, 2016en 2017 van DCMD stichting/

Nijmeegse Onderzoeks Stichting (NOS): 3x   € 20.520:                       € 61.560

Uitgaven in periode 1-1-2015 t/m 15-1-2018:

Salaris postdocs:

S. Albert (8 u/week – 23 mnd: 5.1 persoonsmaanden)                      € 25.800

S. Roosing (4 u/week – 17 mnd: 1.85 persoonsmaanden)                 €   9.359

Salaris analist:    

A. Goercharn-Ramlal (8 u/week – 12 mnd: 2.67 pmd):                        € 9.910

Materialen:                                                                                                 € 12.500

Subtotaal:                                                                                                   € 57.569

Overhead (8%):                                                                                           € 4.605

Totaal:                                                                                                        € 62.174

F.P.M. Cremers, S. Roosing,  3 april 2018